Kişisel Genom Teknolojileri ve Güncel Uygulamaları

Kişisel Genom Teknolojileri ve Güncel Uygulamaları

Kişisel Genom Teknolojileri ve Güncel Uygulamaları

Mikroskobunlarından sonra birlikte hız gezegeninde 1800’lü yaşamdan itibaren insanlarının başında tek bir soru vardı: esas olan ve bu maddedeki esaslı olan sebep nasıl olurdu? Bu ilk ışık 1866 yılında Mendel beye bitkileriyle yürüttüğü melezleme çalışmasıyla yaksa da’nın örneğini kabul eden açıklayan bilim deneyi 1953 yılındaki çalışmalarla Watson ve Crick oldu. Watson ve Crick çalışmalarıla DNA’nın çift sarmal çalışmalarıyla elde edilen bilgilerdeki nükleik asit dizilemelerinin tasarımlarını oluşturdular. Peki çekirdekik asit dizileme teknolojileri bilim insanları için neden bu önemliydi?Canlı kaltsallıların gen dizilerine sahip çekirdekik asitler “DNA” denir. DNA’daki gen dizilerinin sergilenmesinden hoşlanan bir şey düşünüldü. Bu nedenle 1950’liden itibaren DNA’daki genlerin sekanslanması (dizilenmesi) çalışmaları büyük bir önem kazandı. Bilim dünyasını anlattığına göre, bu projeyi planlamak 1990’da yapılacak olan bir projeyi projelendirilecek olan genom projesiyle ilgili bir projedir.

DNA’nın Haritası: İnsan Genom Projesi

1 Ekim 1989 tarihinde İnsan Genom Projesi Araştırması Ulusal Merkezi resmi olarak kuruldu ve merkezin yöneticisi olarak James D. Watson atandı. 1 Ekim 1990 yılında ise çalışmalara başlandı. İlk aşamada projenin 15 yıl süreceği ve 3 milyar dolara mâl olacağı düşünülüyordu. Yapılan çalışmalar sonucunda 2003 yılında insan genlerinin 20.500 kadarı ortaya çıkarıldı ve proje beklenenden daha az bir tutara (2,7 milyar dolara) mâl oldu.

İnsan Genom Projesi’nin tamamlanmasıyla bilim dünyası “post-genomik” devre girdi. Post-genomik süreçle birlikte “Kişiselleştirilmiş Tıp’’ kavramı ortaya çıktı. Kişiselleştirilmiş Tıp kavramını, sağlık girişimlerinin sonuçları arasından (fayda/risk) bireyler arasında bulunan farkların anlaşılması ve popülasyonlar arası genetik ve çevresel çeşitliliğin önceden hesap edilmesi olarak tanımlayabiliriz. Bu sayede insanların gen haritasını çıkararak onların hastalıklarını tedavi ederken kişiye özel ilaçlar kullanılması hedefleniyordu. Bu çalışmanın yapılabilmesi için daha önce DNA sekansında kullanılan Sanger Metodu bırakılarak yerine daha az maliyetli, daha etkili ve daha kısa sürede doğru sonuç veren yeni nesil DNA dizin çalışmaları yapılmaya başlandı.

Sanger Metodu

Genom sekansının belirlenmesinde en yaygın olarak kullanılan yöntem Shotgun Tekniği ile Sanger (dideoksi) metodudur. Sanger metodu zincir sonlandırma metodu olarak da adlandırılır. Shotgun Dizileme metodu uzun DNA parçalarını dizilemek için kullanılır.

Sanger yöntemi ile bir kere de dizi analizi yapılamayacak kadar uzun olan DNA’lar önce küçük parçalara bölünür. Elde edilen her bir parça bir plazmite klonlanır. Klonlanan plazmitler tek tek dizilenir. Bu dizilerin bioinformatik analizlerle bir araya getirilmesi ile uzun DNA parçasının dizisi elde edilir. Dizilemesi yapılacak olan DNA dizilerinin birçok kopyası primer normal deoksi nükleotidler (dNTP) dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dideoksi nükleotidler: ddNTP; ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP ve DNA Polimeraz I enzimi ile karıştırılır. Her yeni nükleotid bir önceki nükleotidin 3’OH ucuna eklenir. Dideoksinukleotid trifosfat (ddNTP) ise 3’OH ucu içermez. Dolayısıyla böyle bir molekül zincir uzamasını durdurur ve zincirin son nükleotidini oluşturur. Bu DNA dizileri kapiller jel elektroforezi kullanılarak okunur.

Yeni nesil dizileme; genom, transkriptom, DNA-protein etkileşimlerinin geniş kapsamlı analizini ucuz, rutin ve yaygın hale dönüştürdüğünden biyolojik araştırmaları önemli ölçüde hızlandırma potansiyeline sahiptir. Yeni Nesil Dizileme Teknolojisi; mRNA, küçük RNA profili, transkripsiyon faktör bağlanma bölgelerinin genom boyu karakterizasyonu, kromatin yapısı ve metilasyonu atasal DNA mikrobiyolojisi ve metagenomik için yeni ve hızlı yollar sağlar.

Yeni Nesil DNA Dizileme (YND)

Yeni nesil dizileme; genom, transkriptom, DNA-protein etkileşimlerinin geniş kapsamlı analizini ucuz, rutin ve yaygın hale dönüştürdüğünden biyolojik araştırmaları önemli ölçüde hızlandırma potansiyeline sahiptir. Yeni Nesil Dizileme Teknolojisi; mRNA, küçük RNA profili, transkripsiyon faktör bağlanma bölgelerinin genom boyu karakterizasyonu, kromatin yapısı ve metilasyonu atasal DNA mikrobiyolojisi ve metagenomik için yeni ve hızlı yollar sağlar.

  • Pirodizileme Metodu:

1996’da Ronaghi ve arkadaşlarının “Sentez Yoluyla Dizileme” (Sequencing by Synthesis) prensibine dayalı “Pyrosequencing” metodunu geliştirmesi bu arayışların sonucu olarak ortaya çıkmıştır. Pirodizileme (pyrosequencing) yüksek işlem hacmi ve düşük maaliyeti sayesinde geleneksel Sanger dizilemenin yerini almıştır. Pirodizilemenin temeli DNA polimeraz aktivitesinin kemilüminesan bir enzim aracılığıyla tespitine dayanmaktadır. Dizileme reaksiyonu, dizilenecek DNA’nın tek sarmalı (ssDNA) üzerinde tamamlayıcı sarmalının sentezlenmesi şeklindedir. Pirodizileme yöntemi kullanılarak, klonlama yapmaksızın5 saatte 100-500 milyon bazlık dizileme yapmak mümkündür. Bu sistem daha önce yıllar alan dizileme projelerini haftalar içinde sonuçlandırmayı mümkün kılmıştır. DNA’nın çift sarmallı yapısını bulan Nobel ödüllü araştırmacı Dr. James Watson’ın genomu bu yöntemle dizinlemiştir. Yine nesli tükenen mamut türünün genomu bu yöntemlerle kısa sürede bütünüyle dizilenebilmiştir. Bu yöntem bu tip karmaşık genomların haricinde, bakteri ve virüs gibi daha basit genomların da bir gün içinde tüm genomunun dizilenebilmesini sağlar.

Şekil.1 Pirodizileme Metodu

  • Ligasyon Yoluyla Dizileme:

Bu metodta da pirodizilemedeki gibi emülsiyon PCR yapılır. Pirodizilemede olduğu gibi primerler adaptör diziler yardımıyla kalıp ipliğe hibridize olur. Bu metodta diğerlerinden farklı olarak DNA polimeraz yerine DNA ligaz enzimi kullanılır. Floresan işaretli oligonükleotid probları kullanılır, problar kalıp DNA’ya hibridize olur ve primerle ligasyona girer. Floresan deteksiyonundan sonra oligonükleotid probların işaretleri 5′ fosfat ucu kesilerek yeni bir ligasyon siklusuna geçilir. Ligasyon, deteksiyon ve ayrılma sikluslan tekrarlanarak DNA dizisi belirlenir.

  • Siklik Geriye Dönüşümlü Sonlandırma (Cyclic Reversible Termination) İle Dizileme:

DNA molekülleri öncelikle slide üzerindeki primerlere bağlanıp amplifiye edilir (bridge amplification). Dört tip ddNTP eklenir ve yeni sentezlenen ipliğin yapısına girmeyen ddNTP’ler yıkanarak uzaklaştırılır. Pirodizilemeden farklı olarak, DNA, her yıkamadan sonra, bir nükleotid uzar. Floresan işaretli nükleotidler kamera aracılığı ile tespit edildikten sonra, 3′ ucundaki sonlandırıcı kimyasal olarak çıkartılır ve sonraki siklusa geçilir.

  • Nano Dizileme:

Bu yöntem de sentez yoluyla dizileme esasına dayanır. Direkt moleküler sensör olarak, biyomühendislikle üretilmiş farklı bir polimeraz ve dNTP’ler kullanılır. Her bir nanomakinede tek bir DNA molekülünün sentezi gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

5- Ion Semikonduktor Dizileme:

Bu metod DNA’nın polimerizasyonu sırasında ortaya çıkan Hidrojen iyonlarının saptanmasına dayanır. Tek bir Kalıp DNA dizisini içeren mikrokuyuya tek tip nükleotid akışı uygulanır. Verilen nükleotid kalıp ipliğe komplementer olduğu durumda yeni oluşan ipliğin yapışma katılır ve hidrojen iyonu salınımı olur. Hidrojen iyonları hipersensitif iyon sensörleri tarafından algılanır. Kalıp DNA’da homopolimer tekrarların varlığı durumunda tek siklusta birden fazla nükleotid yeni ipliğin yapısına girer ve salınan hidrojen iyonlarının sayısına göre daha fazla elektronik sinyal elde edilmesiyle DNA dizisi belirlenir.

Yeni Nesil DNA Dizileme Teknolojisinin Avantajları

  • Yeni Nesil DNA Dizileme Teknolojisi kullanılarak, De Nova Dizileme Yöntemi ile bitki, bakteri, maya, mantar, virüs gibi farklı organizmaların ve bakteri yapay kromozomlarının ultra hızlı ve yüksek doğrulukta dizilenmesi mümkündür.
  • Yüksek hacimli bir analiz yöntemi olmasının yanı sıra barkod yöntemi ile DNA parçalarının hangi örneğe ait olduğu kolayca takip edilebilmektedir.
  • Yeni Nesil DNA Dizileme Sistemleri ile bir çalışmada tüm genom, transkriptom veya küçük hedef bölgelerdeki milyonlarca DNA fragmenti dizilenebilmektedir.
  • Diğer yöntemlerin aksine hem kalitatif hem kantitatif sonuç verebilen bir yöntemdir. Bu nedenle aynı anda hem mutasyon analizi hem de kromozomların sayısındaki artma ya da azalma tespit edilmektedir.
  • Yeni Nesil DNA Dizileme Teknolojisi daha önceki tekniklerden farklı olarak, birçok dizileme reaksiyonu aynı andayapılarak yüksek hacimli ve hızlı sonuç alınmaktadır.
  • Yeni Nesil DNA Dizileme tekniği ile embriyonun genetik kodlarının tümü 24 saatten kısa bir süredeortaya çıkabiliyor ve daha güvenilir sonuçlar veriyor.

Yeni Nesil DNA Dizileme Teknolojisinin Dezavantajları

  • Yeni Nesil DNA Dizileme Sistemleri günümüzde kullanılan teknikler arasında halen altın standart olarak bilinmektedir. Ancak okuma uzunluğunun kısıtlı olması nedeniyle milyonlarca baz içeren genomun tamamını dizileme çalışmaları bu yöntemle oldukça zor olmakta ve uzun sürmektedir.
  • Yeni Nesil DNA Dizileme Teknolojisinin başarılı bir şekilde kullanılması için gelişmiş biyoinformatik analiz araçlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca çok sayıda kısa okuma elde edilmesi de önemli bir problemdir. Okuma uzunluğu ve hata oranı konusu hala geliştirilmektedir.

Kişiselleştirilmiş Genom Teknolojileri ve Etik

İnsanlığın başından beri dönem dönem yeni şeylerin keşfedilmesiyle beraber bu keşiflerin etikle olan ilişkisi hep konuşulmuştur. İnsan Genom Projesi’nin duyurulması ise bu dönemlerden birinin başlangıcı olmuştur çünkü kişilerin gen haritalarının çıkarılmasıyla kişiselleştirilmiş tıp kavramı hayatımıza girmiştir. Kişiselleştirilmiş tıbbın insanlık için büyük bir faydası olsa da etik açıdan bazı soru işaretleri oluşturduğu aşikârdır. Bu konuyu daha objektif inceleyebilmemiz için kişiselleştirilmiş tıbbın faydalarının yanı sıra potansiyel sorunlarını da göz önünde bulundurmamız gerekir. Kişiselleştirilmiş tıbbın en büyük etik güçlerinden biri tabii ki insanların kendisine fayda sağlama olasılığı yüksek tedavileri alabilmesidir bu da kişinin hastalık sürecini en az hasarla atlatmasına sebep olur çünkü hasta sonuç vermeyen tedavilerle zaman kaybetmez. Buraya kadar her şey çok güzelken tam bu noktada kişiselleştirilmiş tıbbın en büyük etik kaygılarından biri ortaya çıkıyor: Bu imkanlara dünyadaki herkes ulaşabilir mi? Çünkü günümüzde bu analizleri yapan kişisel genom teknolojileri oldukça pahalı ve dünyadaki herkesin ulaşması oldukça zor. Bu da kişiselleştirilmiş tedaviye ulaşan insanlarla ulaşamayan insanlar arasındaki eşitsizliği arttırıyor çünkü insan hakları gereği tüm canlılar aynı oranda hayatta kalma hakkına sahiptir.

Kişiselleştirilmiş tıbbın bir diğer büyük sorunu ise mahremiyetle ilgilidir. Gen dizilimimizin yapılması sonucu ortaya çıkan bilgilere kimlerin erişebileceği ve bunun doğurabileceği sonuçlar kişisel haklarımızın ihlaline sebep olabilmektedir. Örneğin kişisel genom analiziyle ortaya çıkan gelecekteki hastalıklarımız bizim ve yakınlarımızın endişelenmesine sebep olarak hayat konforumuzu azaltabilmektedir. Kişilerin böyle durumlarda bilgi edinme veya bilgisiz kalma seçeneğinin olup olmaması ise ayrı bir etik tartışma konusudur.

Kişiselleştirilmiş Genom Teknolojilerini incelerken başlı başına bir etik tartışma konusu olan kürtaj meselesine de değinmekte konuyu daha iyi anlamak için fayda var.  Örneğin Yahudilerin Tay-Sachs hastalığına yatkınlığı olduğu için hamile kadınların embriyoları rutin olarak Tay-Sachs için test edilir. TaySachs hastalığı, beyindeki ve omurilikteki sinir hücrelerinin tahrip olmasına neden olan genetik bir hastalıktır. Bu da Yahudi toplumunda kürtaj sayısının artmasına sebep olabilmektedir. Peki, insanların ağır kronik rahatsızlıkları olması onların yaşamasına engel midir?

Tüm bunları göze aldığımızda bazı olumsuzluklar olsa da ben kişisel genom teknolojilerinin kullanılmasının birçok insanın hayatını pozitif yönde etkileyeceği için kullanılmasında fayda görüyorum çünkü bir şeyin değeri, o şeyin ne kadar büyük bir kitleye hitap ettiği ve ona nasıl etki ettiği belirler diye düşünüyorum.

Peki siz kişiselleştirilmiş genom teknolojileri için ne düşünüyorsunuz? Sizce faydası mı daha büyük yoksa dezavantajı mı?

Yağmur Özdemir

Pharmaino Management Intern

Sağlık Bilimleri Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

Kaynakça:

  • M. Maxam, et al.(1977). A New Method For Sequencing Dna. Proceedings of theNational Academy of Sciences, sf: 560-564. doi: 10.1073/pnas.74.2.560.
  • Illumina Sequencing Technology. (11 Ekim 2010). Alındığı Tarih: 19 Aralık 2020.
  • A. Quail, et al.(2008). A LargeGenomeCenter’sImprovements To TheIllumina Sequencing System. Nature Methods, sf: 1005-1010. doi: 10.1038/nmeth.1270.
  • ExploreIllumina Sequencing Technology. (01 Ocak 2015). Alındığı Tarih: 19 Aralık 2020.
  • M. Heather, et al.(2016). TheSequence Of Sequencers: TheHistory Of Sequencing Dna. Genomics, sf: 1-8. doi: 10.1016/j.ygeno.2015.11.003.
  • History Of Sequencing By Synthesis. (01 Ocak 2015). Alındığı Tarih: 19 Aralık 2020.
  • A. Quail, et al.(2012). A Tale Of Three NextGeneration Sequencing Platforms: Comparison Of Ion Torrent, Pacific BiosciencesAndIlluminaMiseqSequencers. BMC Genomics, sf: 341. doi: 10.1186/1471-2164-13-341.
  • Parson, et al.(2013). Evaluation Of NextGenerationMtgenome Sequencing Using The Ion TorrentPersonalGenome Machine (Pgm). ForensicScience International: Genetics, sf: 543-549. doi: 10.1016/j.fsigen.2013.06.003.
  • E. Deagle, et al.(2013). QuantifyingSequenceProportionsIn A Dna‐BasedDietStudy Using Ion TorrentAmplicon Sequencing: WhichCountsCount? MolecularEcologyResources, sf: 620-633. doi: 10.1111/1755-0998.12103.
  • https://evrimagaci.org/insan-genom-projesi-nedir-insan-ve-diger-canlilarin-genlerinin-tamamini-dizilemek-bilim-ve-teknoloji-icin-neden-onemliydi-9826
  • https://evrimagaci.org/genom-dizileme-teknolojisi-20-yildan-kisa-bir-surede-27-milyar-dolardan-300-dolara-kadar-ucuzladi-966
  • https://dergipark.org.tr/tr/download/article-file/902586
  • Yeni Nesil DNA Dizileme Teknolojileri/Melike Akman, Havvanur Sağdıç, Zeynep Kılıç/ Dokuz Mayıs Üniversitesi Ziraat Fakültesi/ Dr. Öğretim Üyesi YILMAZKAYA

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir